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H1N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆与序列分析

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  摘要 从鸡胚尿囊液中提取H1N2亚型猪流感病毒的RNA,设计一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应成功地扩增了NS1基因。将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,所扩增的片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框,并将该毒株与参考毒株进行了核苷酸及氨基酸序列同源性比较分析。
  关键词 NS1基因;克隆;序列分析
  中图分类号 Q781文献标识码A文章编号 1007-5739(2008)22-0217-02
  
  猪流感病毒是正粘病毒科A型流感病毒属中的成员,其基因组由8个RNA节段组成,其中NS基因是最短的,它含有2个读码框,可编码NS1和NS2 2种蛋白质。非结构蛋白NS1的基因序列高度保守,具有抗原性[1],在SIV检测中具有广阔的应用前景。本试验对该H1N2亚型猪流感病毒NS1基因进行克隆和序列分析,以期为后续研究提供参考。
  
  1材料与方法
  
  1.1试验材料
  Trizol,载体pMD18-T、TOP10感受态细胞、RT-PCR试剂盒,Agarose Gel DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒,限制性核酸内切酶和EcoRⅠ、XhoⅠ,T4 DNA连接酶。猪流感毒株:A/Swine/Guangdong/1999(H1N2)。
  1.2引物设计与合成
  使用Oligo 5.0引物设计软件,参考已发表序列,设计如下一对引物:上游引物:5′-ATGGATTCCAACACTGTG C-3′;下游引物:5′-GGC TGCATGAATGTTATT-3′。
  1.3病毒RNA的提取
  取250μL鸡胚培养尿囊毒液,参照文献[2]相关方法,提取总RNA。将RNA溶于无RNase水中,置-70℃备用。
  1.4目的基因的扩增
  1.4.1病毒RNA反转录。在1μL RNA溶液中依次加入:MgCl2 4μL,10×RNA PCR Buffer 2μL,RNase Free dH2O 8.5 μL,2.5mol/L dNTP Mixture 2μL,RNase Inhibitor 0.5μL,反转录通用引物Uni12(5′-AGCAAAAGCAGG-3′)1μL,AMV Reverse Transcriptase 1μL,共20μL,轻轻混匀,放入PCR仪中,30℃ 8min、50℃ 30min、99℃ 5min、5℃ 5min,所得产物即为cDNA。
  1.4.2PCR扩增。取5μL cDNA作为模版,依次加入MgCl2 6μL,10×PCR Buffer 10μL,d2H2O 76μL,Taq酶1μL,上、下游引物各1μL,共100μL,轻轻混匀。置PCR仪中,94℃预变性2min、94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸3min,进行35个循环,72℃延伸10s。取5μL进行琼脂糖凝胶电泳。
  1.5克隆和序列测定
  按pMD18-T载体试剂盒说明书进行DNA与载体质粒的连接,连接产物按常规方法转化TOP10感受态细胞。挑取白色可能的阳性菌落,提取质粒,进行PCR扩增和EcoRⅠ、XhoⅠ酶切鉴定。初步鉴定阳性克隆送生物公司测序。
  1.6序列比较分析
  用DNAstar软件进行序列比较分析。参考毒株包括Genebank中已公布序列A/Swine/Zhejiang/1/2004(H1N2)、A/Swine/Pingtung/7-12/1999(H1N2)、A/Swine/HongKong/126/1982(H3N2)及试验对比毒株A/Swine/Guangdong/1999(H3N2)。
  
  2结果与分析
  
  2.1RT-PCR
  扩增出的DNA片段约780bp(图1)。
  2.2阳性克隆的初步鉴定
  挑选的克隆提取质粒PCR、酶切鉴定与预测的结果一致,初步认为获得了NS1基因的阳性克隆(图2、图3)。
  2.3目的基因的核苷酸序列分析
  经序列测定,测得插入重组质粒中的外源DNA片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框(660bp)和上下游引物序列、蛋白质合成的起始密码子和终止密码子,表明已成功地克隆到了NS1的全长基因。
  2.4目的基因与参考毒株的核苷酸及氨基酸同源性比较
  经序列比较分析,猪流感毒株Guangdong/1999(H1N2)与参考毒株HS1基因核苷酸及氨基酸同源性如表1所示。可以看出,试验毒株与参考毒株Zhejiang/2004(N1N2)NS1基因同源性最高,核苷酸、氨基酸同源性分别达到96.6%、96.0%。
  
  3小结与讨论
  
  (1)由于流感病毒基因的分段性,每个基因组外部非编码区序列非常有限,加上整个基因组(特别是非编码区)的GC含量较低,这给引物设计带来较大困难[3,4]。本试验在NS1基因5′端和3′端的保守区设计了一对相对理想的引物进行扩增,这可能给以后的试验带来一定困难,如退火温度低、PCR产量低等[5],但其优点是可顺利扩增出特异性良好的目的片段。
  (2)本试验毒株NS1基因开放阅读框全长660bp,编码219个氨基酸。该毒株与参考毒株NS1基因的序列比较显示,核苷酸同源性在92.5%~96.6%之间,氨基酸同源性在92.2%~96.0%之间,试验毒株与参考毒株都属于等位基因群A群[1],试验毒株与参考毒株Zhejiang/2004(H1N2)基因同源性最高,进化关系较为密切。非结构蛋白NS1进化稳定,具有较高的保守性,可用NS1蛋白作为抗原建立猪流感的ELISA诊断试剂盒。
  
  4参考文献
  [1] 殷震.动物病毒学[M].北京:中国农业大学出版社,1996.
  [2] 金冬雁,黎孟枫.分子克隆试验指南(第2版)[M].北京:科技出版社,1993.
  [3] HUDDLASTETALJ A.NucletcAcids Research[J].Vet Res,1982,10(3):1029-1038.
  [4] 傅生芳,常惠云,独军政,等.H9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆及序列分析[J].甘肃农业大学学报,2005,40(5):579-582.
  [5] ASTRID V,GUILLAUME S.Comparision of three nonnested RT-PCR for the detection of influenza virus[J].J Clin Virol,2000,17(3):167-175.
  
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