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马铃薯茎尖脱毒培养中常见的污染问题及防范

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  摘要 总结了马铃薯茎尖脱毒培养过程中常见的污染问题并提出相应的防范措施,以期为马铃薯脱毒核心种苗的获得提供参考依据。
  关键词 马铃薯;脱毒培养;污染;防范
  中图分类号 S336文献标识码B文章编号1007-5739(2008)22-0091-02
  
  马铃薯又名土豆,原产于秘鲁和智利的高山地区,在我国已经有近400年的栽培历史。马铃薯是粮菜兼用的高产作物,具有单产高、适应性强、用途广、营养丰富等特点,是非常有价值的食品,既是我国南北城市周年供应中淡季蔬菜的主供种类,又是农产品深加工与淀粉工业的原料,还可作粮食、饲料,鲜薯制成的薯条、薯片等是快餐业的主要原料,马铃薯全粉是重要的食品加工业添加剂,马铃薯变性、糊化等淀粉是纺织、造纸、粘结剂合成、食品加工和降解塑料等轻工业的重要原料。马铃薯菜粮兼用,耐储运,营养丰富,加工升值高,容易发展成为产业化生产经营。目前,随着中国农业种植结构的调整和种薯商品薯市场需求的不断增加,中国马铃薯种植面积迅速扩大,所需脱毒种薯也越来越多。20世纪50年代蓬勃发展起来的植物组织培养技术,由于其具有周期短、增殖率高及生产不受季节限制等特点,加上培养材料和试管苗的小型化,可使有限的空间培养出大量的植物,在短期内培养出大量的幼苗。因此,植物组织培养技术不仅成为生物科学的一个广阔领域,而且在马铃薯脱毒种薯生产中也是一个不可缺少的必要环节。马铃薯茎尖脱毒培养成功与否是能否获得脱毒核心种苗的关键。鉴于目前我国很多地方马铃薯脱毒种薯都不能普及,市场上供不应求,为了更好地实现马铃薯产业健康、持续的发展,马铃薯脱毒种薯的生产越来越受到人们的重视。如今许多科研单位和种薯生产企业都已经组建了自己的组织培养室。然而,在马铃薯的茎尖脱毒培养过程中常会出现污染问题,这不仅影响了工作的正常开展,还会造成不同程度的经济损失。可以说,目前制约着马铃薯组培苗生产的数量和质量的主要因素之一就是污染问题。因此,解决好马铃薯组织培养中的污染问题将是获得马铃薯脱毒核心种苗的重要技术环节。
  
  1主要污染源
  
  常见的污染情况有细菌污染和真菌污染两大类,它们相应的污染源也就是细菌和真菌。
  
  2污染产生的原因
  
  2.1细菌污染
  若在接种前发现培养基污染,可能是培养瓶不干净而带有不易被杀死的耐高压、高温的杂菌,或者是培养基灭菌不彻底造成的;若在接种后外植体周围发现细菌污染,则证明是植物材料本身带菌引起的,很可能是由于使用了没有消毒好的接种工具以及操作者操作不规范造成的,或者是接种者未能及时发现污染苗,在接种过程中由于交叉感染造成的。
  2.2真菌污染
  若在接种前培养基表面存在大量真菌污染,多数情况是由于培养瓶瓶口封得不严或培养基存放的环境中真菌孢子浓度过大;培养基内部存在大量真菌污染,则可能是母液储备液已经被污染。接种后培养基表面存在真菌污染而且位置不定,如果是初期,可能是因为接种室内真菌孢子浓度过大或超净工作台的滤网已经不干净,如果接种时间较长,主要是因为封口不严或是培养材料本身就携带有内生菌;在培养过程中发现外植体周围出现真菌污染,可能是因为外植体材料本身就带有菌,只是菌源太小,在接种时肉眼无法识别,当接种到培养基以后才能引起感染;若在培养基中发现污染的真菌是零星的分散在培养基中,则可以确定是人为因素造成的,如培养基灭菌不彻底、超净工作台长时间不更换滤膜、接种器具灭菌不彻底、操作不规范等。
  2.3外植体灭菌不彻底
  在室外采集回来的材料,由于生长环境不干净而带有很多杂菌,如果灭菌处理方法不当,造成灭菌不彻底,在接种培养2~3d后就会表现出外植体周围长满细菌或真菌,或者两种菌都有。这样不但得不到预想中的结果,同时还会因为带菌而影响培养室内的其他培养材料,造成交叉感染。
  
  3防范措施
  
  3.1严格消灭污染源
  要确保培养基灭菌彻底,同时应定期清理消毒接种室和培养室,保持环境高度清洁,保证所用容器洁净,培养基及接种器具要彻底灭菌,培养基母液要在冰箱中保存,保持室内干净;对已经被真菌污染的材料要经过高压灭菌后扔掉,即使仅形成菌丝也应该处理后扔掉。
  3.2严格无菌操作
  接种室要经常用紫外线灯消毒灭菌,工作人员在进行接种前要换工作服并带口罩,接种前用75%酒精仔细擦手,方可进行下一步工作;同时工作人员在接种过程中要严格按照无菌操作要求进行材料转接,尽量少走动、不说话,以减少空气震动和流动,减少污染。工作台面及台壁也要用75%酒精消毒;接种所用的剪刀和镊子等也要进行彻底的消毒。
  3.3用正确的灭菌方法进行灭菌
  对在室外采集回来的马铃薯基础材料或是用马铃薯薯块诱导所得的芽,要先在水龙头下冲洗干净,同时拿柔软的毛刷轻刷表面,最后在超净工作台上进行灭菌处理。对马铃薯基础材料的灭菌材料,一般可以用10%次氯酸钠溶液或0.1%升汞溶液进行灭菌。在植物组织培养中对材料进行的灭菌,采用复合灭菌剂处理比使用单一灭菌剂处理灭菌效果更好。因此,在马铃薯组织培养中,为了增强灭菌效果,可采用混合的消毒液或进行多次消毒,即用10%次氯酸钠溶液灭菌处理2~3min,再用0.1%升汞溶液灭菌处理2~3min,这样可以取得很好的灭菌效果。
  3.4保证用于转接的材料无污染
  在马铃薯继代培养过程中,用于扩大繁殖的马铃薯材料本身有无污染是直接影响到接种后污染率高低的关键因素,如果使用了有污染的马铃薯材料转接继代培养则会全部污染。因此,在马铃薯核心种苗的扩繁接种过程中,特别是在转继代培养过程中,对所要转接的马铃薯材料一定要在灯光下仔细观察,确认无污染的材料才能使用。接种前用酒精擦瓶子外壁及瓶盖,防止附在瓶子上的杂菌带入接种室。
  3.5严格接种后的管理
  在材料的培养阶段,应定期清理消毒培养室,保持培养室内空气洁净。定期用甲醛溶液、米醋或臭氧机熏蒸培养室,非工作人员应尽量少进入培养室内。一旦发现污染要及时处理:如果是真菌污染,必须对污染的苗用高压锅灭菌后销毁;如果是细菌污染,而且被污染的材料是比较稀少且珍贵的,可以对所污染的材料进行挽救,具体做法是:将被污染的整瓶材料拿出培养室,用酒精棉将污染处盖住,将植株顶部剪下再次进行灭菌处理后转接到干净的培养基中。
  3.6防止内生菌污染
  内生菌由于其潜伏得较深,表面消毒往往无法将其消灭。有时在外植体的初级培养中也不易被发现,随着继代次数的增加,菌量慢慢累积发展才在培养基上表现出来。遇到这种情况时可通过在培养基中添加一些抑菌剂或抗生素如青霉素、链霉素等,来防止和减少内生菌的污染。
  
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