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在南方红豆杉中接种美丽镰刀菌提高紫杉醇产量的研究

减小字体 增大字体 作者:程 龙 周 红 张 梁 张兰芳 吴小瑜 张向阳 严 琳 诸戌娴  来源:www.bob123.com  发布时间:最新发布
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  摘要 以美丽镰刀菌和南方红豆杉为试验材料,通过在南方红豆杉植株中接种美丽镰刀菌,使两者发生相互作用,达到短期的共生平衡,二年生组和四年生组紫杉醇产量分别较接种前提高55.06%和22.08%,经t检验,试验组与对照组紫杉醇产量变化有显著差异。
  关键词 美丽镰刀菌;南方红豆杉;紫杉醇;产量
  中图分类号 S791.49 文献标识码A文章编号1007-5739(2008)20-0007-01
  
  内共生真菌和宿主植物的相互作用机理,是一个值得深入探究的课题。一般认为植物与内共生真菌呈互利共生的关系[1-3],一方面内共生真菌可以从宿主植物中吸取营养,并得到保护;另一方面内共生真菌产生的代谢物能够促进宿主植物生长发育,增强宿主植物对生物胁迫(食草动物、昆虫、病原菌)及非生物胁迫(高温、干旱、高盐等)的抗逆性。
  2002年,本实验室研究人员从中国南方红豆杉(Taxus mairei)中分离到1株产紫杉醇内生真菌,经鉴定属镰刀菌属,紫杉醇产量在液体培养时约20μg/L[4],命名为美丽镰刀菌(Fusarium mairei)[5]。其后,采用原生质体诱变、发酵条件优化等方法,产量有了较大幅度提高[6]。
  我们同时以美丽镰刀菌和东北红豆杉(T. cuspidate)悬浮细胞为试验材料,通过自己设计制造的耦合式生物反应器[7]进行耦合培养,以紫杉醇作为研究指标,初步研究了内共生真菌与宿主植物细胞的相互作用。经耦合培养,2种细胞的紫杉醇产量均有不同程度的提高,美丽镰刀菌增加了28倍,相应的东北红豆杉悬浮细胞增加了3.5倍[8]。
  既然耦合培养能极大地提高2种细胞的紫杉醇产生能力,而这样的现象只能是2种细胞相互作用的结果,那么,从理论分析,在自然状态下F. mairei对红豆杉植株的影响应该接近于耦合培养所得到的结果。为此,我们设计了在红豆杉植株中接种内共生真菌,以期提高植株的紫杉醇产量。
  
  1材料与方法
  
  1.1材料
  美丽镰刀菌(Fusarium mairei),本试验室保藏;南方红豆杉(Taxus mairei)植株种植于本校药用植物园。
  1.2仪器、试剂和培养基
  1.2.1仪器。HPLC/MS(Platform ZMD 4000,WATERS corp.);Masslynx V4.0 SP4(Micromass Ltd.)。
  1.2.2试剂。paclitaxel标准品(97%,HPLC),购自Sigma公司;其余试剂均为分析纯。
  1.2.3培养基。沙氏固体、液体培养基。
  1.3方法
  1.3.1T. mairei植株分组。T. mairei植株采用随机分组,以树龄分为2大组,每组10株,分别为二年生组(A组)和四年生组(B组),每大组分为2小组,每组5株,分别为对照组(Actrl、Bctrl)和试验组(AExp、BExp)。
  1.3.2F. mairei接入T. mairei植株后植株紫杉醇含量变化的观察。弱化生长的F. mairei分别以等量接入各组T. mairei植株,每天在每株植株相对应的部位取样,测定紫杉醇含量。
  1.3.3紫杉醇含量的测定。紫杉醇含量测定采用HPLC/MS法[9]。
  1.3.4数据的检验。测定得到的数据用t检验进行分析判断。
  
  2结果
  
  2.1紫杉醇的含量变化
  由表1、图1可知,试验A组紫杉醇含量较未接种前增加55.06%,而相应的对照A组仅增加9.38%,试验组与对照组间紫杉醇含量变化差异极显著(P<0.01)。
  试验B组紫杉醇含量较未接种前增加22.08%,而相应的对照B组增加-1.87%,试验组与对照组间紫杉醇含量变化差异极显著(P<0.01)。
  2.2试验B组紫杉醇含量的变化对于具体的试验株来说,其紫杉醇含量的变化是不均一的,目前尚无规律可循。由图2可知,以接种前为0d计100%,则株1、株4基本无变化,而最大的株5则增加了143.69%。
  
  3讨论
  
  对于T. mairei来说,F. mairei是外源的病源菌,一旦接入,必然导致机体的“免疫”反应。紫杉醇作为一种植物保卫素(phytoalexin)起着抵御外界生物侵入的作用,在感染病菌时必然出现大量合成,而对于真菌亦是如此。因此,在T. mairei中接入F. mairei后紫杉醇产量的提高是比较容易得到解释的。该情形与美丽镰刀菌和东北红豆杉耦合培养所得的结果相似[8]。而对于F. mairei来说,紫杉醇作为其正常代谢产物,自身具有一定的抗性,在这种情况下,两者将达到一种“妥协”,2种细胞将出现真正的“共生”局面。
  由图2可知,试验B组各株间紫杉醇含量的增加是不均衡的,其中株1、株4基本无变化,是否提示F. mairei可能未接入T. mairei中,或接入后未能在T. mairei中生长。因此,尚需对接种方法和接种量进行进一步研究。
  
  4结论
  
  在T. mairei中接入F. mairei确能通过其相互作用提高紫杉醇产量,但F. mairei的弱化、接入量、接入时间、接种方式等有待于进一步研究。
  
  5参考文献
  
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